Molekularna i serološka dijagnostika korona (COVID-19) infekcije


Poliklinika Analiza je u svoj laboratorij uvela AMP Rapid Test – brzi imunokromatografski test za kvalitativno 𝗼𝗱𝗿𝗲đ𝗶𝘃𝗮𝗻𝗷𝗲 𝗜𝗴𝗚 𝗶 𝗜𝗴𝗠 𝗮𝗻𝘁𝗶𝘁𝗶𝗷𝗲𝗹𝗮 𝗻𝗮 𝗦𝗔𝗥𝗦-𝗖𝗼𝗩-𝟮 𝘃𝗶𝗿𝘂𝘀 𝘂 𝘂𝘇𝗼𝗿𝗸𝘂 𝘀𝗲𝗿𝘂𝗺𝗮 𝗶 𝗽𝗹𝗮𝘇𝗺𝗲 𝗽𝗼 𝗰𝗶𝗷𝗲𝗻𝗶 𝗼𝗱 𝟭𝟱𝟬,𝟬𝟬𝗸𝗻
Testiranje je moguće obaviti u našim poslovnicama u Zagrebu, Splitu, Zadru i Šibeniku. Rezultati testiranja gotovi su isti ili sljedeći dan.
Više informacija pozivom na 021 688 888

Sami rezulatati laboratorijskih testiranja nisu dovoljni za postavljanje dijagnoze niti za terapiju, oni moraju biti interpretirani od strane liječnika!

Postojeće metode za otkrivanje prisutnosti virusa ili specifičnih antitijela

Vrste metoda

Detekcija virusa RNA: RT-PCR

  • Uzorak: nazofaringealni bris
  • RNA se ekstrahira iz respiratornih uzoraka (nazofaringealni bris), prepisuje se generirajući u komplementarnu DNA reverznom transkriptazom, amplificira se RT-PCR primerom specifičnim za SARS-CoV-2 (Covid-19) i detektira pomoću gel elektroforeze ili fluorescentnim reporterskim probama
  • Detekcija se može usredotočiti na različite RNA-kodirajuće proteine poput ORF1ab i N gena. Metoda je specifična za detektiranje samog virusa (odsutnog kod izliječenih osoba).  Najčešće korišteni test u prvoj fazi epidemije; može odrediti je li netko inficiran ili ne. Ovaj tip testa koristi se za detektiranje i drugih virusa sa sličnim simptomima
  • Za dobivanje rezultata potrebno je nekoliko sati, odgovarajući RT-PCR aparat i ne može detektirati osobe sa razvijenim imunitetom

Otkrivanje IgG i IgM: Imunokromatografski test

  • Uzorak je puna krv (plazma ili serum) prikupljena ili iz prsta ili venepunkcijom
  • Kvalitativno otkrivanje IgG i IgM antitijela na SARS-CoV-2 u uzorcima pune krvi, seruma i plazme kao pomoć u dijagnostici infekcije coronavirusom (Covid-19)
  • Otkrivanje IgG i IgM antitijela u uzorku pune krvi, seruma ili plazme pomoću ELISA metode upotrebom anti-humanog IgG i anti-humanog IgM
  • Brzi test: nanošenje uzorka na kazetu za uzorke (S) i promatranje formiranja obojenih linija. Nakon dodavanja uzorka, specifična IgM i/ili IgG antitijela, ako ih ima, vežu se na SARS-CoV-2 antigene konjugirane na obojene čestice
  • Rezultati su gotovi vrlo brzo (10-15 min). Test pogodan za otkrivanje  i bolesnih i izliječenih osoba (cjelokupna imunološka populacija). Ovaj je test osobito koristan za definiranje opsega populacije koja je došla u kontakt sa virusom (uključujući i asimptomatske slučajeve), a opsežni skrining s ovim testom pomoći će u budućem predviđanju razvoja bolesti
  • Metoda ne detektira prisustvo virusa već antitijela na virus  (još uvijek prisutna kod izliječenih osoba)

Otkrivanje proteina virusa: Imunokromatografski test

  • Uzorak: nazofaringealni bris
  • Kvalitativno otkrivanje nukleokapsidnog proteina (N proteina) monoklonskim antitijelima
  • Nanošenje uzorka na kazetu za uzorke (S) i promatranje formiranja obojenih linija
  • Rezultati su dostupni vrlo brzo (10-15 min); test specifičan za detektiranje virusa (pozitivitet nije prisutan kod izliječenih osoba)
  • Test još uvijek nije dostupan; ne može detektirati osobe sa razvijenim imunitetom

    Razvoj antitijela kod infekcije SARS-CoV-2 virusom

    Koronavirusna bolest 2019 (COVID-19) uzrokovana koronavirusom (SARS-CoV-2) karakterizirana je povišenom temperaturom, kašljem i umorom dok se curenje iz nosa i proljev pojavljuju kod manjeg broja inficiranih osoba. Kod mlađih bolesnika zabilježeni su i nagli gubitak okusa i mirisa. Teži slučajevi bolesti manifestiraju se razvojem pneumonije (upala pluća), pa se bolest u početku i definirala kao neidentificirana virusna pneumonija. U najtežim slučajevima može doći do razvoja akutnog respiratornog distres sindroma (ARDS), septičkog šoka, metaboličke acidoze, poremećaja koagulacijskih parametara.

     

    Inkubacijski period bolesti je 2-14 dana sa medijanom od 5-6 dana. SARS-CoV-2 virus prenosi se kapljičnim putem pri kihanju i kašljanju, kao i indirektno putem kontaminiranih ruku, izlučevinama oboljele osobe s obzirom da virus može preživjeti i nekoliko sati na površinama.

     

    U kratkom vremenu bolest je poprimila pandemijske razmjere, a razlog leži u činjenici da se ljudi do sada nisu susreli sa ovim virusom. Svi smo “imunološki naivni.” Nemamo prirodni imunitet.

     

    Nastojanja da se otkrije što veći broj inficiranih osoba, da se ograniči daljnje širenje bolesti, osigura odgovarajuće liječenje pacijenata i u konačnici ukloni virus iz populacije postaje globalni imperativ, a kako bi to uspjeli u upotrebi su različite dijagnostičke metode čije osnovne informacije su navedene u prethodnom članku.

    Trenutni standard u dijagnostici COVID-19 temelji se na molekularnoj dijagnostici polimerazne lančane reakcije (PCR) iz brisa grla i/ili nazofarinksa. Zahvaljujući PCR metodi SARS-CoV-2 RNA može se otkriti u respiratornim uzorcima tijekom akutne faze, kada se određuje jeli osoba inficirana ili ne. Za dobivanje rezultata potrebno je nekoliko sati i nije namijenjena praćenju razvoja imuniteta kod inficiranih osoba.

    Međutim objavljena istraživanja pokazala su, da su mnogi slučajevi koji su bili snažno epidemiološki povezani s izloženošću SARS-CoV-2 virusu i s tipičnim radiološkim nalazima pluća, ostali RNA negativni  u uzorcima iz gornjih dišnih putova.

     

    Postoje četiri potencijalna razloga ove situacije:

    • koncentracija virusnih čestica u uzorcima gornjih dišnih putova manja je  nego u uzorcima iz donjih dišnih putova
    • koncentracija virusnih čestica u različitom stadiju infekcije varira u širokom rasponu
    • kvalitetno uzimanje briseva zahtijeva educirane i vješte zdravstvene radnike
    • kvaliteta reagensa može varirati

    Posljedično, ovi problemi mogu dovesti do značajnog odgađanja postavljanja rane dijagnoze, praćenja i liječenja bolesnika i otvoriti put novom širenju bolesti.

    S obzirom da je od početka COVID-19 infekcije prošlo već nekoliko mjeseci, postavilo se dodatno pitanje, širi li se SARS-CoV-2 virus samo respiratornim putem ili postoje i drugi putovi širenja. Pitanje se baziralo na činjenici da novi virus SARS-CoV-2 ima 74,5% sličnosti genoma sa SARS-CoV, a u bolesnika zaraženih SARS-CoV i MERS-CoV crijevna infekcija uočena je u kasnijim fazama bolesti. Istraživanje je pokazalo da bolesnici zaraženi SARS-CoV-2 virusom, mogu lučiti virus u crijevima u ranoj ili kasnoj fazi bolesti, budući da je 5-og dana od početka infekcije porastao broj pozitivnih analnih briseva.

    Ovo je još jednom potvrdilo dvije ključne činjenice:

    • proširiti dijagnostiku i na druge uzorke briseva, poput analnih briseva sa razmatranjem fekalno-oralne transmisije
    • nužnost preventivnih mjera pranja i dezinficiranja ruku temeljito sapunom i tekućom vodom najmanje 20 sekundi (alternativno-dezinfekcijsko sredstvo na bazi 60% alkohola) te izbjegavanje dodirivanja lica, usta i očiju neopranim rukama

    Međutim sva ova razmatranja i dijagnostički alati bazirali su se na dokazivanju virusa iz različitih uzoraka, ali postavljaju se pitanja: što je sa razvojem imuniteta na SARS-CoV-2, koliko imunitet traje, ponaša li se ovaj virus kao i ostali patogeni i mogu li nam serološki testovi pomoći u još boljem dijagnosticiranju pozitivnih osoba.

    Imperativ ljudske evolucije je preživljavanje i prijenos nasljednih svojstava na potomke, a da bismo u tome uspjeli nužno je bilo razviti kvalitetan imunološki odgovor na patogene oko nas.

    Ključni cilj ljudskih antitijela protiv SARS-CoV-2  je takozvani S protein – „spike” na površini virusa. Razvoj antitijela normalan je imunološki odgovor organizma na postojanje patogenog čimbenika, pa iako je SARS-CoV-2 novi virus i ne znamo puno o razvoju imuniteta kod čovjeka, novije studije dale su vrlo ohrabrujuće podatke, jer su dokazale porast antitijela već u prvom tjednu infekcije i to u početku IgM, a nakon toga i IgG antitjela, čak i kod pacijenata koji su SARS-CoV-2 RNA bili negativni.

    Rast razine antitijela počinje 5-6-og dana od početka infekcije, pri čemu je prisutnost antitijela  u prvih 7 dana < 40% da bi se vrlo brzo povećala  na 80 do 100% 15-og dana. Suprotno tome virusna RNA se smanjivala od 67% 7-og dana, do 46% 15-og dana pa nadalje.

    Ispitivanje antitijela može imati važnu ulogu kod:

    • kod pacijenata u početnoj fazi bolesti kod kojeg nije potvrđena SARS-CoV-2 RNA iz briseva gornjih dišnih putova
    • zdravog bliskog kontakta u početnom samoizolacijskom periodu, pri čemu porast antitijela upućuje da se radi o vjerojatnom prenosiocu bolesti pa bi kod takvog pojedinca trebalo češće provoditi briseve i pažljivo ga pratiti
    • pacijenata s potvrđenom SARS-CoV-2 RNA kod kojih seropozitivnost ukazuje na induciranje specifičnog humoralnog imunološkog odgovora
    • iako do sada nije razjašnjena uzročno-posljedična veza između imunološkog odgovora i ishoda bolesti dokazano je da se visoki titar ukupnih antitijela protiv virusa može smatrati rizičnim čimbenikom za razvoj težih oblika bolesti neovisno o dobi, spolu, pratećim bolestima

     

Serološki testovi baziraju se na dvije metode: imunokromatografija i ELISA metoda (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).  Zahvaljujući ovim metodama u vrlo kratkom vremenu (10-15 minuta) određuje se  prisutvo IgM i IgG antitijela te se pomaže u otkrivanju kako bolesnih tako i izliječenih osoba (cjelokupna imunološka populacija), a poseban naglasak je na otkrivanju asimptomatskih slučajeva.

Iako kod primjene seroloških testova treba biti oprezan i primjenjivati samo testove kod kojih je dokazano ne postojanje križne reaktivnosti sa bilo kojim drugom infekcijom, smatramo da bi sve države trebale iskoristiti sada već postojeću bazu znanja i svoje vrhunske stručnjake kako bi same razvile testove i ne ovisile o uvozu, a koji će biti ponuđeni cjelokupnoj populaciji, u ne komercijalne svrhe, jer kako pandemija bude prolazila serološki testovi donositi će dodatne dobrobiti:

  • identificiranje osoba koje su se opravile i razvile imunitet, stoga će se moći vratiti na svoja radna mjesta, što je posebno važno kod zdravstvenih djelatnika, policije, vojske ali i zaposlenika svih drugih gospodarskih grana, jer u protivnom vrlo brzo doći će do urušavanja kompletne ekonomije i na svjetskoj razini. Kako broj takvih osoba bude rastao stvoriti će se kolektivni imunitet, blokirajući prijenos virusa, što će pomoći svima
  • utvrđivanje istinskog broja osoba koji su se zarazile i oporavile bez simptoma ili s minimalnim simptomima, što je ključno za izračunavanje IFR COVID-19 (omjer smrtnosti od infekcije)
  • možda će plazma imunih osoba poslužiti u liječenju teško oboljelih od COVID-19 (to ćemo ostaviti budućnosti)

Iako još puno moramo naučiti o reakciji našeg imunološkog sustava na SARS-CoV-2 virus i nemamo podataka koliko imunitet može trajati, serološki testovi imaju važnu vrijednost u dijagnostici i liječenju uz RNA testove i pravilno provedene epidemiološke izvide.

Izvori:

    • Shi X, Gong E, Gao D, et al. Severe acute respiratory syndrome associated coronavirus is detected in intestinal tissues of fatal cases. Am J Gastroenterol. 2005;100 (1):169–176.
    • Ding Y, He L, Zhang Q, et al. Organ distribution of severe acute respiratory syndrome (SARS) associated coronavirus (SARS-CoV) in SARS patients: implications for pathogenesis and virus transmission pathways. J Pathol. 2004;203(2):622–630
    • Zhao J, Wang H, Yuan Q et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019, Lancet, March 2020. DOI: 1101/2020.03.02.20030189
    • Zhang W, Du RH, Li B, Zheng XS et al. Molecular and serological investigation of 2019-nCoV infected patients: implication of multiple shedding routes. Emerging Microbes & Infections; February 2020; doi.org/10.1080/22221751.2020.1729071

Sami rezulatati laboratorijskih testiranja nisu dovoljni za postavljanje dijagnoze niti za terapiju, oni moraju biti interpretirani od strane liječnika!

English