Molekularna i serološka dijagnostika korona (COVID-19) infekcije

Poliklinika Analiza je u svoj laboratorij uvela brzi dijagnostički test za odvojeno detektiranje IgM,  IgG antitijela specifičnih za SARS- CoV2 virus u uzorku seruma i plazme u svrhu profesionalne dijagnostike infekcije uzrokovane SARS-CoV-2 virusom po cijeni od 150,00 kn
Više informacija pozivom na 021 688 888

Postojeće metode za otkrivanje prisutnosti virusa ili specifičnih antitijela

Vrste metoda

Detekcija virusa RNA: RT-PCR

• Uzorak: nazofaringealni bris
• RNA se ekstrahira iz respiratornih uzoraka (nazofaringealni bris), prepisuje se generirajući u komplementarnu DNA reverznom transkriptazom, amplificira se RT-PCR primerom specifičnim za SARS-CoV-2 (Covid-19) i detektira pomoću gel elektroforeze ili fluorescentnim reporterskim probama
• Detekcija se može usredotočiti na različite RNA-kodirajuće proteine poput ORF1ab i N gena. Metoda je specifična za detektiranje samog virusa (odsutnog kod izliječenih osoba).  Najčešće korišteni test u prvoj fazi epidemije; može odrediti je li netko inficiran ili ne. Ovaj tip testa koristi se za detektiranje i drugih virusa sa sličnim simptomima
• Za dobivanje rezultata potrebno je nekoliko sati, odgovarajući RT-PCR aparat i ne može detektirati osobe s razvijenim imunitetom

Otkrivanje IgG i IgM: Imunokromatografski test

• Uzorak je puna krv (plazma ili serum) prikupljena ili iz prsta ili venepunkcijom
• Kvalitativno otkrivanje IgG i IgM antitijela na SARS-CoV-2 u uzorcima pune krvi, seruma i plazme kao pomoć u dijagnostici infekcije koronavirusom (Covid-19)
• Otkrivanje IgG i IgM antitijela u uzorku pune krvi, seruma ili plazme pomoću ELISA metode upotrebom anti-humanog IgG i anti-humanog IgM
• Brzi test: nanošenje uzorka na kazetu za uzorke (S) i promatranje formiranja obojenih linija. Nakon dodavanja uzorka, specifična IgM i/ili IgG antitijela, ako ih ima, vežu se na SARS-CoV-2 antigene konjugirane na obojene čestice
• Rezultati su gotovi vrlo brzo (10-15 min). Test pogodan za otkrivanje  i bolesnih i izliječenih osoba (cjelokupna imunološka populacija). Ovaj je test osobito koristan za definiranje opsega populacije koja je došla u kontakt s virusom (uključujući i asimptomatske slučajeve), a opsežni skrining s ovim testom pomoći će u budućem predviđanju razvoja bolesti
• Metoda ne detektira prisustvo virusa već antitijela na virus  (još uvijek prisutna kod izliječenih osoba)

Otkrivanje proteina virusa: Imunokromatografski test

• Uzorak: nazofaringealni bris
• Kvalitativno otkrivanje nukleokapsidnog proteina (N proteina) monoklonskim antitijelima
• Nanošenje uzorka na kazetu za uzorke (S) i promatranje formiranja obojenih linija
• Rezultati su dostupni vrlo brzo (10-15 min); test specifičan za detektiranje virusa (pozitivitet nije prisutan kod izliječenih osoba)
  • kod pacijenata u početnoj fazi bolesti kod kojeg nije potvrđena SARS-CoV-2 RNA iz briseva gornjih dišnih putova
  • zdravog bliskog kontakta u početnom samoizolacijskom periodu, pri čemu porast antitijela upućuje da se radi o vjerojatnom prenosiocu bolesti pa bi kod takvog pojedinca trebalo češće provoditi briseve i pažljivo ga pratiti
  • pacijenata s potvrđenom SARS-CoV-2 RNA kod kojih seropozitivnost ukazuje na induciranje specifičnog humoralnog imunološkog odgovora
  • iako do sada nije razjašnjena uzročno-posljedična veza između imunološkog odgovora i ishoda bolesti dokazano je da se visoki titar ukupnih antitijela protiv virusa može smatrati rizičnim čimbenikom za razvoj težih oblika bolesti neovisno o dobi, spolu, pratećim bolestima Test još uvijek nije dostupan; ne može detektirati osobe s razvijenim imunitetom
    

    Razvoj antitijela kod infekcije SARS-CoV-2 virusom

    Koronavirusna bolest 2019 (COVID-19) uzrokovana koronavirusom (SARS-CoV-2) karakterizirana je povišenom temperaturom, kašljem i umorom dok se curenje iz nosa i proljev pojavljuju kod manjeg broja inficiranih osoba. Kod mlađih bolesnika zabilježeni su i nagli gubitak okusa i mirisa. Teži slučajevi bolesti manifestiraju se razvojem pneumonije (upala pluća), pa se bolest u početku i definirala kao neidentificirana virusna pneumonija. U najtežim slučajevima može doći do razvoja akutnog respiratornog distres sindroma (ARDS), septičkog šoka, metaboličke acidoze, poremećaja koagulacijskih parametara.

    Inkubacijski period bolesti je 2-14 dana s medijanom od 5-6 dana. SARS-CoV-2 virus prenosi se kapljičnim putem pri kihanju i kašljanju, kao i indirektno putem kontaminiranih ruku, izlučevinama oboljele osobe s obzirom na to da virus može preživjeti i nekoliko sati na površinama.

     

    U kratkom vremenu bolest je poprimila pandemijske razmjere, a razlog leži u činjenici da se ljudi do sada nisu susreli s ovim virusom. Svi smo “imunološki naivni.” Nemamo prirodni imunitet.

    Nastojanja da se otkrije što veći broj inficiranih osoba, da se ograniči daljnje širenje bolesti, osigura odgovarajuće liječenje pacijenata i u konačnici ukloni virus iz populacije postaje globalni imperativ, a kako bi to uspjeli u upotrebi su različite dijagnostičke metode čije osnovne informacije su navedene u prethodnom članku.

    Trenutni standard u dijagnostici COVID-19 temelji se na molekularnoj dijagnostici polimerazne lančane reakcije (PCR) iz brisa grla i/ili nazofarinksa. Zahvaljujući PCR metodi SARS-CoV-2 RNA može se otkriti u respiratornim uzorcima tijekom akutne faze, kada se određuje jeli osoba inficirana ili ne. Za dobivanje rezultata potrebno je nekoliko sati i nije namijenjena praćenju razvoja imuniteta kod inficiranih osoba.

    Međutim objavljena istraživanja pokazala su, da su mnogi slučajevi koji su bili snažno epidemiološki povezani s izloženošću SARS-CoV-2 virusu i s tipičnim radiološkim nalazima pluća, ostali RNA negativni  u uzorcima iz gornjih dišnih putova.

    Postoje četiri potencijalna razloga ove situacije:

    • koncentracija virusnih čestica u uzorcima gornjih dišnih putova manja je  nego u uzorcima iz donjih dišnih putova
    • koncentracija virusnih čestica u različitom stadiju infekcije varira u širokom rasponu
    • kvalitetno uzimanje briseva zahtijeva educirane i vješte zdravstvene radnike
    • kvaliteta reagensa može varirati

    Posljedično, ovi problemi mogu dovesti do značajnog odgađanja postavljanja rane dijagnoze, praćenja i liječenja bolesnika i otvoriti put novom širenju bolesti.

    S obzirom na to  da je od početka COVID-19 infekcije prošlo već nekoliko mjeseci, postavilo se dodatno pitanje, širi li se SARS-CoV-2 virus samo respiratornim putem ili postoje i drugi putovi širenja. Pitanje se baziralo na činjenici da novi virus SARS-CoV-2 ima 74,5% sličnosti genoma sa SARS-CoV, a u bolesnika zaraženih SARS-CoV i MERS-CoV crijevna infekcija uočena je u kasnijim fazama bolesti. Istraživanje je pokazalo da bolesnici zaraženi SARS-CoV-2 virusom, mogu lučiti virus u crijevima u ranoj ili kasnoj fazi bolesti, budući da je 5-og dana od početka infekcije porastao broj pozitivnih analnih briseva.

    Ovo je još jednom potvrdilo dvije ključne činjenice:

    • proširiti dijagnostiku i na druge uzorke briseva, poput analnih briseva sa razmatranjem fekalno-oralne transmisije
    • nužnost preventivnih mjera pranja i dezinficiranja ruku temeljito sapunom i tekućom vodom najmanje 20 sekundi (alternativno-dezinfekcijsko sredstvo na bazi 60% alkohola) te izbjegavanje dodirivanja lica, usta i očiju neopranim rukama

    Međutim sva ova razmatranja i dijagnostički alati bazirali su se na dokazivanju virusa iz različitih uzoraka, ali postavljaju se pitanja: što je sa razvojem imuniteta na SARS-CoV-2, koliko imunitet traje, ponaša li se ovaj virus kao i ostali patogeni i mogu li nam serološki testovi pomoći u još boljem dijagnosticiranju pozitivnih osoba.

    Imperativ ljudske evolucije je preživljavanje i prijenos nasljednih svojstava na potomke, a da bismo u tome uspjeli nužno je bilo razviti kvalitetan imunološki odgovor na patogene oko nas.

    Ključni cilj ljudskih antitijela protiv SARS-CoV-2  je takozvani S protein – „spike” na površini virusa. Razvoj antitijela normalan je imunološki odgovor organizma na postojanje patogenog čimbenika, pa iako je SARS-CoV-2 novi virus i ne znamo puno o razvoju imuniteta kod čovjeka, novije studije dale su vrlo ohrabrujuće podatke, jer su dokazale porast antitijela već u prvom tjednu infekcije i to u početku IgM, a nakon toga i IgG antitijela, čak i kod pacijenata koji su SARS-CoV-2 RNA bili negativni.

    Rast razine antitijela počinje 5-6-og dana od početka infekcije, pri čemu je prisutnost antitijela  u prvih 7 dana < 40% da bi se vrlo brzo povećala  na 80 do 100% 15-og dana. Suprotno tome virusna RNA se smanjivala od 67% 7-og dana, do 46% 15-og dana pa nadalje.

    

  • Ispitivanje antitijela može imati važnu ulogu kod:

Serološki testovi baziraju se na dvije metode: imunokromatografija i ELISA metoda (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).  Zahvaljujući ovim metodama u vrlo kratkom vremenu (10-15 minuta) određuje se  prisustvo IgM i IgG antitijela te se pomaže u otkrivanju kako bolesnih tako i izliječenih osoba (cjelokupna imunološka populacija), a poseban naglasak je na otkrivanju asimptomatskih slučajeva.

Iako kod primjene seroloških testova treba biti oprezan i primjenjivati samo testove kod kojih je dokazano ne postojanje križne reaktivnosti s bilo kojim drugom infekcijom, smatramo da bi sve države trebale iskoristiti sada već postojeću bazu znanja i svoje vrhunske stručnjake kako bi same razvile testove i ne ovisile o uvozu, a koji će biti ponuđeni cjelokupnoj populaciji, u ne komercijalne svrhe, jer kako pandemija bude prolazila serološki testovi donosit će dodatne dobrobiti:

• identificiranje osoba koje su se oporavile i razvile imunitet, stoga će se moći vratiti na svoja radna mjesta, što je posebno važno kod zdravstvenih djelatnika, policije, vojske ali i zaposlenika svih drugih gospodarskih grana, jer u protivnom vrlo brzo doći će do urušavanja kompletne ekonomije i na svjetskoj razini. Kako broj takvih osoba bude rastao stvorit će se kolektivni imunitet, blokirajući prijenos virusa, što će pomoći svima
• utvrđivanje istinskog broja osoba koji su se zarazile i oporavile bez simptoma ili s minimalnim simptomima, što je ključno za izračunavanje IFR COVID-19 (omjer smrtnosti od infekcije)
• možda će plazma imunih osoba poslužiti u liječenju teško oboljelih od COVID-19 (to ćemo ostaviti budućnosti)

Iako još puno moramo naučiti o reakciji našeg imunološkog sustava na SARS-CoV-2 virus i nemamo podataka koliko imunitet može trajati, serološki testovi imaju važnu vrijednost u dijagnostici i liječenju uz RNA testove i pravilno provedene epidemiološke izvide.

Izvori:

• • Shi X, Gong E, Gao D, et al. Severe acute respiratory syndrome associated coronavirus is detected in intestinal tissues of fatal cases. Am J Gastroenterol. 2005;100 (1):169–176.
  • Ding Y, He L, Zhang Q, et al. Organ distribution of severe acute respiratory syndrome (SARS) associated coronavirus (SARS-CoV) in SARS patients: implications for pathogenesis and virus transmission pathways. J Pathol. 2004;203(2):622–630
  • Zhao J, Wang H, Yuan Q et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019, Lancet, March 2020. DOI: 1101/2020.03.02.20030189
  • Zhang W, Du RH, Li B, Zheng XS et al. Molecular and serological investigation of 2019-nCoV infected patients: implication of multiple shedding routes. Emerging Microbes & Infections; February 2020; doi.org/10.1080/22221751.2020.1729071

Tekst je namijenjen isključivo djelatnicima u zdravstvu.
Sami rezultati laboratorijskih testiranja nisu dovoljni za postavljanje dijagnoze niti za terapiju, oni moraju biti interpretirani od strane liječnika!