PREDNOSTI QUANTUM DOT TEHNOLOGIJE (TEHNOLOGIJA KVANTNE TOČKE) U ODNOSU NA DOSADAŠNJE METODE DIJAGNOSTIKE HELICOBACTER PYLORI

Dijagnostika Helicobacter pylori do sada je bila temeljena na dvije skupine testova: invazivni dijagnostički testovi koji uključuju endoskopski pregled, histološku analizu, brzi ureaza test te izolaciju bakterije dok neinvazivni dijagnostički testovi uključuju urea izdisajni test, nalaz antigena H.pylori u stolici i serološke testove na H.pylori.

Neinvazivni dijagnostički testovi:

a) Urea izdisajni test: temelji se na činjenici da H.pylori proizvodi ureazu koja razgrađuje ureu na amonijak i CO2. Pacijent popije otopinu uree s izotopom ugljika 13C ili 14C koju onda ureaza razgradi ako je H.pylori prisutan. Oslobođeni 13CO2 ili 14CO2 prvo prelaze u krvotok, zatim u pluća gdje se mjere u izdisaju nakon 30 minuta od unosa uree u organizam. Test ima visoku specifičnost i osjetljivost, no mogu se javiti i lažno pozitivni rezultati u prisutnosti drugih mikroorganizama koji proizvode ureazu u želucu čovjeka. Kod pacijenata koji se liječe inhibitorima protonske pumpe kao i kod onih koji su zaraženi metabolički neaktivnim kokoidnim oblikom H.pylori, rezultati mogu biti i lažno negativni, a osjetljivost je niža i kod pacijenata koji su operirali želudac. Također izotop ugljika 14C zbog svoje radioaktivnosti nije preporučen za upotrebu kod djece i trudnica.

b) Test antigena H. pylori u stolici: dvije vrste antigenskih testova dostupne su u dijagnostici infekcije H.pylori – enzimski imunotest baziran na monoklonalnim antitijelima, te imunokromatografski test. Točnost rezultata ovog testa smanjuje se, nepoštivanjem perioda prestanka korištenja inhibitora protonske pumpe od barem 4 tjedna, činjenicom da je uzorak stolice nehomogen, pa se može dogoditi uzimanje uzorka s mjesta na kojem nema H.pylori, a također vodenasti uzorak stolice kao i prisustvo krvarenja u gornjem dijelu gastrointestinalnog sustava umanjuju točnost rezultata.

c) Serološki testovi: budući da se kod pacijenata najčešće radi o kroničnoj infekciji uzrokovanoj H.pylori, potrebno je koristiti testove utemeljene na IgG antitijelima. Najčešće vrste testova koji se koriste su ELISA, imunokromatografija i Western blot. Antitijela mogu ostati prisutna u organizmu i godinama nakon izlječenja i zbog toga se serološki testovi ne mogu koristiti u procjeni uspjeha izlječenja.

Invazivni dijagnostički testovi:

Invazivni dijagnostički testovi uobičajeno se koriste kod bolesnika starijih od 50 godina te kod pojave alarmantnih simptoma neovisno o dobi.

a) Endoskopski pregled: endoskopijom je potrebno vizualizirati cijeli gornji dio gastrointestinalnog sustava (jednjak, ulazni dio, tijelo i izlazni dio želuca te početni dio duodenuma) što s jedne strane predstavlja neugodnost za pacijenta dok sa druge strane, sam endoskopski zahvat bez dodatnih dijagnostičkih testova ne može dijagnosticirati prisustvo H.pylori, jer ne postoji “tipičan znak” njenog prisustva.

b) Brzi ureaza test: je test provjere prisutnosti bakterije Helicobacter pylori u uzorku uzetom biopsijom antruma želuca. S obzirom da je test utemeljen na enzimatskoj reakciji u obzir treba uzeti parametre koji utječu na reakciju, a to su koncentracija supstrata, koncentracija i aktivnost enzima, temperatura i vrijeme. Kako bi se dokazao pozitivan ureaza test potrebno je minimalno 100 000 Helicobacter pylori u uzorku biopsije kako bi se potakla promjena boje indikatora, također uzorak bi trebao biti točno uzet s mjesta gdje se H.pylori nalazi. Na sam rezultat testa utječe i korištenje lijekova (antagonisti H2 receptora, spojevi bizmuta, blokatori protonske pumpe, antibiotici). Važno je spomenuti i lažnu pozitivnost testa koja se, može dogoditi kod otpuštanja ureaze iz drugih bakterija koje ju proizvode, kao što su Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis i Enterobacter cloacae. Osjetljivost i specifičnost brzih ureaza testova niža je i kod pacijenata s akutnim gastrointestinalnim krvarenjem.

c) Histološka analiza bioptata želuca: predstavlja metodu iznimne osjetljivosti, međutim nekoliko čimbenika ometaju dijagnostičku točnost metode, a uključuju mjesto i broj uzetih uzoraka (za potpunu histološku analizu potrebno je čak pet uzoraka, dva iz antruma, dva iz korpusa i jedan iz angularnog područja), odabir metode bojenja, prethodno korištenje terapije i iskustvo patologa koji analizira preparate.

d) Izolacija H.pylori iz bioptata: metoda je sa skoro 100% specifičnosti i s osjetljivosti koja varira između 85% i 95%, međutim loša kvaliteta samog uzorka, spor transport, izloženost aerobnom okolišu, visoko aktivni gastritis, konzumacija alkohola i dugotrajno korištenje blokatora histaminskih receptora može negativno utjecati na točnost dijagnostičke metode.

U novije vrijeme u svrhu dijagnostike i tipizacije H.pylori dostupne su i molekularne metode dijagnostike –  RAPD-PCR (engl. randomly amplified polymorphic DNA) metoda, RFLP-PCR (engl. restriction fragment length polymorphism) te metoda otiska (fingerprint) genomske DNA. Međutim ove metode izvan većih bolničkih centara nisu u široj primjeni.

Upravo na tragu mogućnosti koje pruža molekularna dijagnostika, ali sa svrhom široke dostupnosti, brzog dobivanja rezultata, visoke osjetljivosti i specifičnosti u dijagnostici i tipizaciji H.pylori, poliklinika Analiza uvela je Quanum Dot tehnologiju (tehnologija kvantne točke) koja predstavlja revoluciju u imunokemijskim metodama, jer predstvlja “dvostruku sendvič metodu” koja služi u detekciji antitijela na ureazu, CagA i VacA antigen.

Reagens predstavlja antitijelo, koje reagira na antitijelo iz seruma, a u samoj metodi antitijelo je detektirani antigen. Pri reakciji antitijela i antigena (antijelo) stvara se signal koji analizator pretvara u brojčanu vrijednost izmjerenih antitijela. Ureaza olakšava preživljavanje H.pylori u kiselim uvjetima želuca, dok su najbitniji čimbenici virulencije H. pylori vakuolizirajući citotoksin A (VacA) i citotoksinu pridruženi gen (cagA). VacA poslije endocitoze stvara vakuole i na taj način ošteti stanice endotela. CagA pripada cag otoku patogenosti (PAI) koji se sastoji od 31 gena a oni kodiraju T4SS. T4SS je igli slična struktura koja prodire kroz membrane epitelnih stanica želuca i u njih ubacuje produkte H. pylori, uključujući i CagA. CagA je najvirulentniji čimbenik povezan s ovom bakterijom.

Ovom metodom postignuto je:

• izbjegavanje neugodnosti testiranja (testiranje se provodi iz uzorka krvi)
• široka dostupnost testiranja
• izbjegavanje negativnog utjecaja transporta uzorka na rezultat
• istovremena detekcija antitijela na tri čimbenika H.pylori
• tipizacija i određivanje stupnja patogenosti H.pylori ovisno o pozitivnosti pojedinih antitijela (pozitivnost CagA i VacA antitijela vodi ka razvoju ulkusa i karcinoma želuca)
• proces je potpuno automatiziran s kvantitativnim (brojčanim) prikazom rezultata
• izbjegnut je utjecaj trenutno korištene terapije na rezultate testiranja
• izbjegnut je utjecaj hrane i alkohola na rezultate testiranja
• izbjegnut je utjecaj eventualnog krvarenja u gastrointestinalnom sustavu
• izbjegnuta je lažna pozitivnost zbog prisutnosti drugih bakterija koje proizvode ureazu
• mogućnost primjene kod djece i trudnica jer nema radijacije (kao kod korištenja ugljika 14C kod izdisajnog testa)
• procjena potrebe za eradikacijskom terapijom
• mogućnost adekvatnog praćanja uspjeha eradikacijske terapije

Reference:

1. Vaira D, Holton J, Menegatti M i sur. Review article: invasive and noninvasive tests for Helicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol Ther 2000;14(Suppl 3):13–22.
2. Marušić M, Presečki V, Katičić M, Dominis M, Kalenić S. The place and role of serologic methods in detecting Helicobacter pylori infection. Coll Antropol 2006;30:529–33.
3. Yakoob J, Jafri W, Abid S i sur. Role of rapid urease test and histopathology in the diagnosis of Helicobacter pylori infection in a developing country. BMC Gastroenterol 2005;1:38–42.
4. Stolte M, Meining A. The updated Sydney system: classification and grading of gastritis as the basis of diagnosis and treatment. Can J Gastroenterol 2001;9:591–8.